Способ индуцирования у млекопитающих защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter, вакцина для индуцирования защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter у млекопитающих, способ индуцирования пассивной защиты у млекопитающих против инфекции

Есть еще 8 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ ЗАЩИТНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИНФЕКЦИЮ , ВАКЦИНА ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ ЗАЩИТНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИНФЕКЦИЮУ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ПАССИВНОЙ ЗАЩИТЫ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРОТИВ ИНФЕКЦИИИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭНДОГЕННОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ ИНФИЦИРОВАННЫХ(57) 1. Способ индуцирования у млекопитающих защитного иммунного ответа на инфекцию , включающий введение антигена, отличающийся тем, что в качестве антигена вводят иммуногенно эффективное количество полиаминокислотного препарата, представляющего достаточное количество эпитопов, проявляемых уреазой, эндогенной для организма , причем введение указанного препарата осуществляют к поверхности слизистой оболочки млекопитающих. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит интактную уреазу, очищенную из организма. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит пептиды, гомологичные с ферментативно неактивными частями аминокислотных последовательностей уреазы. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит пептиды, негомологичные с аминокислотными последовательностями уреазы и обнаруживающие эпитопы, перекрестно реагирующие с уреазой. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит уреазу 3684 1 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит по меньшей мере субъединицы уреазы с ферментативной активностью или без ферментативной активности. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит антиидиотипические антитела к уреазе. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит пептиды, иммунологически перекрестно реагирующие с уреазой. 9. Способ по пп. 3 и 8, отличающийся тем, что указанные пептиды получены при помощи химического синтеза. 10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит антигены уреазы, полученные техникой рекомбинантных ДНК. 11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат содержит субгенные фрагменты уреазы,полученные техникой рекомбинантных ДНК. 12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные препараты содержат субгенные фрагменты уреазы, полученные в виде слитых белков. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные слитые белки содержат субъединицы холерного токсина. 14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат вводят в сочетании с адъювантом для слизистой оболочки. 15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанный адъювант для слизистой оболочки представляет собой холерный токсин. 16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным млекопитающим является человек. 17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный препарат вводят в соединении с гидроксилированным фосфатом кальция. 18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанный гидроксилированный фосфат кальция представляет собой гидроксиапатит. 19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный гидроксиапатит присутствует в виде частиц,пригодных для транспорта через эпителий. 20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную уреазу вводят перорально, назально, ректально или на слизистую глаза. 21. Вакцина для индуцирования защитного иммунного ответа на инфекциюу млекопитающих, содержащая антиген и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, отличающаяся тем,что в качестве антигена содержит полиаминокислотный препарат, представляющий эпитопы, проявляемые уреазой, эндогенной для организма. 22. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит адъювант для слизистой оболочки. 23. Способ индуцирования пассивной защиты у млекопитающих против инфекции , включающий введение антител, отличающийся тем, что вводят иммунологически активное количество специфических для уреазыантител, причем введение осуществляют к поверхности слизистой оболочки млекопитающих. 24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанные антитела представляют собойантитела,специфические для уреазы. 25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком. 26. Способ оценки эндогенного иммунного ответа млекопитающих, инфицированных ,включающий введение антигена и отбор пробы, отличающийся тем, что отбор пробы осуществляют из желудочно-кишечного тракта млекопитающих, а оценку эндогенного иммунного ответа осуществляют путем определения в пробе присутствия антител, реагирующих с эпитопами, проявляемыми уреазой, эндогенной для . 27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что включает дополнительную стадию введения вакцинымлекопитающему перед введением . Приоритет по пунктам 03.11.92 по пп. 1 - 3, 5, 6, 8, 10 - 27 06.07.93 по пп. 4, 7, 9. Изобретение относится к профилактике и лечению желудочной инфекции у млекопитающих, в том числе у человека. Более конкретно данное изобретение касается вакцины, пригодной для применения для профилактики и лечения инфекцииу млекопитающих, в том числе у человека, и способа лечения больных, страдающих от желудочной инфекции, ее последствий, таких, как хронический гастрит или пептическая язва, и профилактики рака желудка. Инфекция микроорганизмовэпителия желудка человека, вызывающая гастрит, является основным фактором в развитии пептических язв и лимфомы желудка и может быть фактором риска для развития рака желудка 1-3. Наиболее частным инфекционным агентом является, за ним следует с гораздо меньшей частотой. Н.представляет собой тонкий -образный грамот 3 3684 1 рицательный микроорганизм, который рутинно получают из желудочных биопсий взрослых и детей с гистологическим подтверждением гастрита или пептической язвы. Доказательство причинной связи между Н.и гастродуоденальным заболеванием получено в исследованиях, проведенных на добровольцах, больных с язвами и раком желудка, гнотобиотических свиньях и не содержащих возбудителей инфекций грызунах. Что касается этиологии, постулаты Коха были удовлетворены развитием гистологически подтвержденного гастрита в ранее не инфицированных индивидуумах после поглощения жизнеспособных микроорганизмов 4-11 и лечением для ликвидации Н.с исчезновением гастрита, у больных с пептической язвой, снижение скорости рецидивов 12. Вопреки чувствительностико многим антимикробным агентам очень часто трудно добиться ликвидации установленных инфекций Н.при помощи антимикробных агентов 13. Микроорганизм обнаружен внутри слизистой оболочки, покрывающей эпителей желудка, и в желудочных ямках Эти местоположения, по-видимому, не позволяют достичь адекватных антимикробных уровней, даже при пероральном введении антибиотиков в высокой дозе. В настоящее время большая часть специалистов рекомендует тройную терапию, а именно соль висмута в сочетании с лекарственными средствами такими, как тетрациклин и метронидазол, в течение 2-4 недель. Однако эффективность этого или других химиотерапевтических режимов остается субоптимальной. Кроме того, такое лечение может вызывать серьезные побочные реакции. В настоящее время мало известно относительно роли иммунной системы слизистой оболочки в желудке. Распределение продуцирующих иммуноглобулинклеток в нормальном желудочном пространстве указывает, что продуцирующиеклетки плазмы составляют 80 всей популяции клеток плазмы. Кроме того, число продуцирующихклеток плазмы, присутствующих в желудочном пространстве, сравнимо с другими покрытыми слизью мембранами 14, 15. Ряд исследований на человеке 16 и животных моделях 8, 10 продемонстрировали специфическиеиответные реакции в сыворотке и в желудочных секрециях в ответ на инфекцию . Однако наблюдение, что инфекция Н.сохраняется в виде хронической инфекции годами вопреки индукции местного и общего иммунного ответа, не вдохновляет на развитие стратегий иммунизации.а. сообщили о способности инфицировать не содержащих возбудителей заболеваний грызунов бактерии, близко родственной Н. , и воспроизводимо документировали гистологический гастрит 9, 10. С тех пор эта пара бактерия-хозяин была принята в качестве хорошей модели для исследования вызываемогогастрита и инициирующих его факторов 17.а. показали, что повторяемая пероральная иммунизация неочищенным лизатом Н.с холерным токсином в качестве адъюванта индуцирует сильный желудочно-кишечный у мышей и хорьков в виде образования антител против Н.13. Кроме того,а иа недавно сообщил, что пероральная иммунизация неочищенным лизатом Н.индуцировала защиту против инфекции Н.у мышей 21, 22. Однако точная природа антигена (антигенов), ответственных за индикацию этой защиты, не была определена, и ни в одной из информаций нет предположений о том, что защитный антиген (антигены) Н. , которые индуцируют защиту против этого патогена, будут индуцировать перекрестно-реактивную защиту против другого вида. Мы впервые показали, что Н.и Н. , разрушение ультразвуком, вызывают образование антител и некоторые из антител против Н.могут давать перекрестную реакцию с Н.и наоборот 24, 25. Основа этой перекрестной реактивности неизвестна. На основе гомологии, существующей между различными аминокислотными последовательностями различных известных уреаз, было сделано предположение, что уреаза могла бы применяться в качестве вакцины против Н.26. Тем не менее кросс-реактивность не является правилом.ипоказали несколько лет назад, что уреазы,иобнаруживают кроссреактивность друг с другом, тогда как уреазы канавалии мечевидной ииммуннологически отличаются перекрестная реактивность уреазы Н.с другими уреазами другихбыла разумным требованием, не было данных, демонстрирующих, что она имеет место, до тех пор, пока мы не показали, что часть моноклональных антител против Н.прекрасно реагировали с уреазой Н.25. В дальнейшем . Рарро показал, что мыши, инфицированные Н. , продуцируют антитела, которые прекрасно реагируют с уреазой Н. , но не с уреазой канавалии мечевидной (. Рарро, неопубликованные данные, 1993). Применение уреазы Н.или родственных уреаз в качестве вакцины против инфекции Н.было предложено ранеев ЕРО 367 644 28. Однако эта заявка не содержит доказательства вакцинации какого-либо млекопитающего против какой-либо инфекциипри помощи уреазы. Более того, в то время как гомология последовательности с другими бактериальными уреазами может поддерживать применение уреазы в качестве кандидата на применение в вакцине против Н. , текущие знания об инфекции Н.у человека не поддерживают возможность применение уреазы. Во-первых, вопреки факту, что инфицированные индивидуумы часто дают сильную ответную реакцию с образованием антител на уреазу, иммунный ответ в виде антител против уреазы не приводит к удалению бактерий или кон 4 3684 1 тролю инфекции. Во-вторых, Н.способна выводить уреазу из клетки и сбрасывать ее с поверхности клетки 19, 20. Поэтому уреаза может не представлять собой подходящую мишень для развития защитного иммунного ответа слизистой оболочки. Действительно, считают, что иммунная защита слизистой оболочки опосредована в основном секреторным , агглютинирующая активность которого будет ослаблена, если узнаваемый антиген может быть сброшен патогеном-мишенью и вследствие этого служить ловушкой для защитных антител. В-третьих, уреаза, по-видимому, токсична для эпителиальных клеток в культуре, и предполагают, что она принимает участие в разрушении слизистой оболочки и в образовании пептических язв. Следовательно, ее применение в качестве антигена может быть токсичным. Несмотря на это мы решили, что этот антиген не мог бы быть потенциально эффективной вакциной, если во-первых, мы вводили бы ее перорально в достаточно высокой дозе, чтобы вызвать более сильный иммунный ответ, чем природно наблюдаемый ответ,во-вторых, количество продуцируемых антител было бы достаточно высоким, чтобы связывать всю уреазу, сброшенную и несброшенную микроорганизмом,в-третьих, мы применяли бы субъединицы уреазы или вид молекул, которые не являются токсичными. Короче говоря, остается потребность в эффективном лечении и профилактике вызываемой Н.желудочной инфекции у человека. Полученные недавно данные предполагают возможность получения вакцины против этого заболевания, но не дают ясной идентификации определенного антигена (антигенов), общей для всех штаммов Н. , которые могли бы быть включены в надежную и эффективную вакцину. В данном изобретении мы идентифицировали уреазный антиген Н.как кандидат для вакцины и показали его эффективность на модели животных Эти результаты были неожиданными в свете естественной истории инфекций, называемых . Было обнаружено, что можно индуцировать иммунитет у млекопитающих, восприимчивых к желудочнокишечной инфекции, вызываемой , путем использования эпитопов уреазы, проявляющихся на или около поверхностей организмов , и применения их в качестве вакцины-мишени (целевой вакцины). Иммунитет можно было индуцировать при помощи природной уреазы, но также субъединицы рекомбинатной уреазы, продуцируемой в виде ферментативно неактивной, т.е. нетоксичной формы. Изобретение обеспечивает способ индуцирования иммунитета к инфекциипутем введения на поверхность слизистой оболочки млекопитающего полиаминокислотного препарата, т.е. смеси пептидов и/или белков, вместе с подходящим адъювантом. Этот полиаминокислотный препарат представляет множество эпитопов, характерных для уреазного фермента, эндогенного для инфицированного организма . Введение полиаминокислотного препарата можно проводить пероральным путем. Активный ингредиент препарата может содержать природные или биосинтетические эпитопы и быть в различных формах. Неисчерпывающий перечень возможных препаратов включает в себя очищенные, встречающиеся в природе или рекомбинантные препараты бактериального или иного происхождения, переваренные ферментами препараты уреазы, слитые белки, содержащие эпитопы уреазы, усеченные формы уреазы или пептиды, гомологичные аминокислотной последовательности уреазы. Поскольку развитие иммунитета зависит от индукции гуморальных или/и клеточных иммунных ответных реакций, которые связывают инфицирующий организм , предпочтительными препаратами являются те, которые наиболее точно воспроизводят эпитопы уреазы, эндогенной для инфицирующего организма. Например, препараты, обнаруживающие эпитопы уреазы Н. , предпочтительны для введения больным, восприимчивым к Н. . Однако, согласно важному аспекту данного изобретения, было обнаружено, что можно применять также и уреазу из других видов. Например, мы показали, что инфекцию Н.у мышей можно предупредить введением уреазы из Н. . Согласно одному аспекту изобретения, обеспечен способ индуцирования в млекопитающем-хозяине защитного иммунного ответа на инфекцию , предусматривающий введение к поверхности слизистой оболочки хозяина иммунологически эффективного количества антигена уреазы, способного индуцировать защитный иммунный ответ, предпочтительно уреазы Н.или В субъединицы уреазы Н. . Согласно другому аспекту данного изобретения обеспечена композиция вакцины, пригодная для предупреждения инфекции , содержащая эффективное количество антигена, предпочтительно уреазы Н.или субъединицы В уреазы Н. , способного вызывать в хозяине защитный иммунный ответ на инфекцию , в соединении с фармацевтически приемлемыми носителем или разбавителем. Согласно дальнейшему аспекту данного изобретения, обеспечен способ наделения млекопитающегохозяина пассивной защитой против инфекции , предусматривающий введение к поверхности слизистой оболочки хозяина иммунологически эффективного количества антител, специфических для уреазы, продуцируемых в хозяине, иммунизированном уреазой, предпочтительно уреазой Н.или субъединицей В Н. , способными вызывать защитный иммунный ответ на инфекцию . Изобретение будет описано далее со ссылкой на сопутствующий рисунки, в которых фиг. 1-6 являются графическими представлениями результатов, даваемых в табл. 1-6. 3684 1 Авторы данного изобретения обнаружили, что пероральное введение полиаминокислотных препаратов,имеющих эпитопы уреазы Н. , дает повышение защитного иммунологического ответа против Н.у мышей, модели животных общепринятой значимости для исследования иммунного ответа на инфекцию 9. Эффект защитного иммунного ответа заключается в том, что иммунизированные животные при введении патогена обнаруживают значительно сниженную частоту инфицирования по сравнению с неиммунизированными животными. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что пероральная иммунизация мышей с применением субъединицы В Н. , полученной в виде ферментативно неактивного рекомбинантного белка,дает повышение защитного иммунологического ответа у мышей против Н. . Эффект этого защитного иммунного ответа заключается в том, что иммунизированные животные при введении патогена обнаруживают также значительно сниженную частоту инфицирования по сравнению с неиммунизированными животными, которые действительно заражаются. Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ индуцирования в млекопитающем-хозяине защитного иммунного ответа против инфекции . Способ предусматривает стадию введения к поверхности слизистой оболочки млекопитающего, в том числе человека, иммунологически эффективного количества антигена уреазы, предпочтительно уреазы Н. , способного индуцировать такой защитный иммунный ответ. Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает способ индуцирования в млекопитающем-хозяине защитного иммунного ответа против инфекции . Способ предусматривает стадию введения к поверхности слизистой оболочки животного, в том числе человека, иммунологически эффективного количества антигена субъединицы В рекомбинантной ферментативно неактивной уреазы, предпочтительно субъединицы В рекомбинантной уреазы Н. , способного индуцировать такой защитный иммунный ответ. Изобретение предусматривает также внутри сферы его действия лечение или профилактику млекопитающих, в том числе человека, от вызываемойинфекции, иммунологически эффективное количество уреазы или ее единицы, способных индуцировать защитный иммунный ответ на инфекцию , вводят к поверхности слизистой оболочки больного. Предпочтительной уреазой является уреаза Н.или субъединица В Н. . Уреаза может вводиться отдельно или в соединении с гидроксилированным фосфатом кальция, например гидроксиапатитом, в качестве частицы-носителя. Кроме того, предпочтительно введение уреазы Н.в соединении с адъювантом для слизистой оболочки, субъединицей В холерного токсина, мурамилдипептидом или другими подобными адъювантами. Не будучи связанными какой-либо теорией, авторы данного изобретения убеждены, что введение антигена уреазы или ее субъединицы В к поверхности слизистой оболочки стимулирует общую иммунную систему слизистой оболочки и, возможно, локальные сайты в слизистой оболочке желудка, в том числе появлениеантител, специфических для Н. , в желудочных секрециях, которые предупреждают инфекцию. Поскольку проведение предклинических испытаний кандидатов-вакцин для применения в лечении человека на моделях животных является рутинным, авторы считают, что методология данного изобретения эффективна для человека, в частности, в профилактике и лечении пептических язв, гастрита, злокачественных заболеваний желудка и других состояний, возникающих как результат присутствия Н.и/или Н.. А-Бактериальные культуры и очистка уреазы. Штамм Н. , применяемый в этом исследовании, происходил из больного с язвой двенадцатиперстной кишки и был субкультивирован на чашках с ВН агарозой до гомогенности. Н.культивировали в подходящей среде, обычно в ВН (- ) среде, содержащей 0,25 дрожжевого экстракта и 10 эмбриональной сыворотки теленка с добавлением 0,4 селективного комплемента(конглютинин 69). Бактерии инкубировали в течение ночи при микроаэрофильных условиях при 37 С в колбах, которые закрывали герметично и встряхивали при 37 С в течение 2-3 дней для получения жидкой культуры. Культуру можно также приготовить на чашках с агарозой, содержащей ВН с 0,25 дрожжевого экстракта и 5 овечьей крови при микроаэрофильных условиях при 37 С в течение 3 дней. Количество бактерий определяли по оптической плотности раствора ВН при 660 нм, причем одна единица оптической плотности соответствовала 108 бактерий. Культуры на чашках с агарозой перед этим ресуспендировали в 154 мл . Одним из предпочтительных в настоящее время источников полиаминокислоты, несущей эпитопы уреазы, является очищенная уреаза, например уреаза Н. , полученная по особому способу., .. . 265, 9464 - 9469, модифицированному как описано ниже. После культивирования Н.собирали в воду, перемешивали вращением и откручивали еще раз для получения супернатанта. Затем раствор,содержащий уреазную активность Н.(оцениваемую по быстрому тесту на уреазу, см. ниже), хроматографировали на колонке -6 и фракции, обладающие сильной уреазной активностью, собирали и диализовали в течение ночи и вновь хроматографировали на анионо-обменном геле. Фракции элюировали в буфере сс увеличивающейся концентрацией и собранные фракции с сильной уреазной активностью подвергали раздельно гель-электрофорезу с - с последующим окрашиванием Кумасси. Две отдельные полосы с мол. массами приблизительно 63 и 29 кДа идентифицировали как уреазу. Фракции, содержащие уреазу, соединяли вместе, получая очищенную уреазу Н.с чистотой 95-99 . 6 3684 1 В-Пероральная иммунизация уреазой, очищенной из Н. . Хотя предпочтительно применять очищенную уреазу Н. , полученную, как описано, в качестве антигенного материала, следует понимать, что также можно использовать в качестве антигенного материала любую уреазу или ее субъединицу, либо встречающиеся в природе либо полученные техникой рекомбинантной ДНК, а также переваренный фрагмент уреазы, слитые белки, содержащие фрагменты целой уреазы, усеченные конструкции уреазы и другие пептидные или белковые препараты, проявляющие эпитопы уреазы,которые способны индуцировать защитный иммунный ответ на инфекцию(см. ниже). Таким образом, можно применять уреазу, имеющую существенную гомологию относительно уреазы Н.и эффективную в индуцировании защитной перекрестной иммунной ответной реакции на . Примером такой уреазы является уреаза канавалии мечевидной, которая имеет 70 гомологии с уреазой Н. . Изобретение, следовательно, не лимитировано применением интактной уреазы и охватывает применение любого полиаминокислотного препарата, который имеет эпитопы уреазы и эффективен в генерировании защитного иммунологического ответа у хозяина на инфекцию . Обычно уреаза, имеющая гомологию 70-95 ,например гомологию 80-90 , относительно уреазы Н. , может применяться в качестве уреазы в данном изобретении. Неограничивающий перечень источников потенциально применимых препаратов уреазы включает в себя эндогенные уреазы разных видов , уреазу из других бактерий, таких, какили, и по аналогии любую другую уреазу при условии, что эти уреазы имеют общие перекрестно реактивные эпитопы с уреазой Н. . Гены уреазы всех упомянутых выше организмов являются потенциальным инструментом для экспрессии рекомбинантных уреазных продуктов в виде целого белка или в виде его части. Неограничивающий перечень потенциально применимых препаратов уреазы включает в себя пептиды,полученные из очищенной уреазы (источники упомянутые выше) при помощи физических и/или химических способов расщепления (с применением протеаз, например 8-протеазы, трипсина или др. ), или пептиды,синтезированные химически и содержащие общие последовательные эпитопы с уреазой. Другими потенциально применимыми эпитопами являются эпитопы, идентифицированные по их перекрестной реактивности с уреазой в результате скрининга при помощи антител против уреазы. Такими пептидами могут быть природные пептиды или полученные химическим синтезом. Кроме того, такие пептиды могут быть результатом экспрессии рекомбинантного произвольного олигонуклеотида. Другим источником потенциально применимых эпитопов являются эпитопы, подобные уреазе и полученные как результат генерирования антиидиотипических антител в уреазе. Такие антиидиотипические антитела, генерируемые в любом иммуннокомпетентном хозяине, получают иммунизацией этого хозяина антителами противоуреазы для генерирования антител против антител против уреазы, которые сохраняют структурные гомологии с уреазой. Обсуждение здесь фокусируется на применении уреазы, природно продуцируемой Н.(раздел В). Однако должно быть понятно, что уреаза или ее субъединицы или конструкции, упомянутые выше, способные индуцировать желаемый защитный иммунный ответ, могут быть получены техникой рекомбинантной ДНК, хорошо известной исследователям. Эффективность отдельных препаратов можно определить рутинным введением с применением моделей животных, пероральными введением кандидата-вакцины и введением патогена с применением протокола, подобного описанной ниже процедуре или идентичного этой процедуре. Табл. 1 и 2 ниже и фиг. 1-5 описывают результаты, полученные при пероральной иммунизации мышей очищенной уреазой Н. . В этом первом эксперименте введение антигена Н.проводили путем перорального введения мышам уреазы Н. , очищенной как описано в разделе А, и соединенной с кристаллами гидроксиапатита, применяемыми в качестве носителя для усиления связывания М-клеток и поглощения. Холерный токсиндавали в качестве адъюванта для слизистой оболочки. В этом эксперименте группы самок/ шестинедельных мышей перорально иммунизировали 30 мкг очищенной уреазы Н. , соединенной с 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина в качестве адъюванта, во временных точках 0,7, 14 и 21 (дни). Затем мышам вводили дважды 108 Н.на 28 и на 30 день. Для сравнительных целей подобные самки/ шестинедельных мышей перорально иммунизировали полным лизатом (гомогенатом, полученным при разрушении клеток ультразвуком) Н.и 10 мкг холерного токсина в те же дни 0,7, 14 и 21. Мышам вводили на 28 и 30 день Н. . Лизат Н.получали сбором клеток из клеточных культур, осаждением их центрифугированием, ресуспендированием осадка в 0,9 с последующей обработкой ультразвуком. В качестве контроля самки/ шестинедельных мышей были перорально ложно иммунизированы 10 мкг холерного токсина и 1 мг гидроксиапатита в те же дни 0,7, 14 и 21. Всех мышей содержали, иммунизировали и заражали параллельно. Всех мышей убивали на 35 день. С-Пероральная иммунизация субъединицами рекомбинантной уреазы Н. . Гены, колирующие структурные единицы А и В уреазы Н. , были получены при помощи клонирования с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии со стандартными процедурами, основы 7 3684 1 вающимися на ранее опубликованных последовательностях 29. Эти гены встраивали в вектор (названный 40), предназначенный для высокоэффективной экспрессии и легкой очистки чужеродных генов в Е . Вкратце чужеродный ген встраивали справа от терморепрессированного промотора и в рамке последовательности,кодирующей повтор из шести гистидинов. Для отбора трансформаторов на векторе присутствовалген. При подходящих температурных условиях полученный рекомбинантный белок имел шесть гистидинов на конце, что делало возможной ее одноступенчатую очистку на содержащей никель колонке. Как субъединицу А,так и субъединицу В рекомбинантной уреазы Н.экспрессировали раздельно в Еи очищали на содержащей никель колонке до чистоты 95 . Хотя предпочтительно применение рекомбинантной уреазы Н. , полученной как описано выше,следует понимать, что можно также применять в качестве антигенного материала любую уреазу или субъединицу уреазы, полученные рекомбинантной техникой (например, слитый белок), имеющие антигенные сайты уреазы, которые способны вызвать защитный иммунный ответ на инфекцию . Так, можно применять конструкцию гена уреазы, имеющей существенную гомологию с уреазой Н.и эффективный в индуцировании перекрестного защитного иммунного ответа на . Примером такой уреазы является уреаза канавалии мечевидной, которая имеет 70 гомологии с уреазой Н. , или уреазой Н. ,которая имеет 88 гомологии с уреазой Н. . Следовательно, изобретение не лимитировано применением генов Н.и их генных продуктов и включает в себя применение любой рекомбинантной уреазы или ее субъединицы, которые эффективны в генерации защитного иммунологического ответа в хозяине на инфекцию . Как правило, рекомбинантная уреаза, имеющая 70-95 гомологии, например 8090 гомологии, с уреазой Н.может применяться в данном изобретении в качестве антигена рекомбинантной уреазы. Обсуждение здесь фокусируется на применении субъединиц А и В рекомбинантной уреазы Н. ,продуцируемой Е(раздел С). Однако должно быть понятно, что рекомбинантная уреаза или ее субъединицы или конструкции, упомянутые выше, способные вызывать желаемый защитный иммунный ответ, могут быть получены с применением других способов рекомбинантной ДНК и других эукариотических или прокариотических экспрессирующих векторов, хорошо известных в данной области исследований. Табл. 3, 4 и 5 ниже на фиг. 6 описывают результаты, полученные при пероральной иммунизации мышей субъединицами уреазы Н. , полученными Е . В этом эксперименте введение антигена Н.проводили пероральным введением мышам субъединиц А или В рекомбинантной уреазы Н. , полученных в Еи очищенных, как описано выше, и соединенных с кристаллами гидроксиапатита, применяемых в качестве носителя для усиления связывания М-клеток и поглощения. Холерный токсиндавали в качестве адъюванта слизистой оболочки. В этом эксперименте группы самокшестинедельных мышей перорально иммунизировали 30 мкг субъединиц А и В рекомбинантной уреазы Н. , соединенных с 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина в качестве адъюванта, в дни 0,8, 14 и 21. Затем мышам трижды вводили 108 Н.на 32, 34 и 36 день. Для сравнения подобных самок/ шестинедельных мышей перорально иммунизировали 30 мкг субъединицы В рекомбинантной уреазы Н. , соединенной с гидроксиапатитом и 10 мкг холерного токсина, на 0,8, 14 и 21 день. Мышей заражали трижды на 32, 34 и 36 день Н. . В качестве контроля самок/ шестинедельных мышей перорально ложно иммунизировали 10 мкг холерного токсина и 1 мг гидроксиапатита на 0,8, 14 и 21 день. Затем мышам вводили Н.на 32, 34 и 36 день. Всех мышей иммунизировали и заражали в параллелях. Животных убивали на 48 день (через 12 дней после заражения) или через 10 недель после заражения.-Анализ желудочных биопсий, крови и кишечных секреций. Биопсии брали из желудка, кровь получали из сердца. Кишечник удаляли и промывали 1 мМ ФМСФвбуфере для получения кишечных секреций для твердофазного иммунноферментного анализа. Для оценки защиты против колонизации Н.желудочные биопсии из каждого животного подвергали скринингу на присутствие Н.путем быстрого определения уреазной активности по тесту( ). Вкратце желудочные биопсии погружали в 0,5 мл смеси поставщика из мочевины и фенолового красного индикатора рН. Уреазная активность продуцирует аммиак и бикарбонат из мочевины и сопровождается калориметрическим изменением раствора в сторону более высокого поглощения при 550 нм. Уреазную активность измеряют количественно спектрофотометрически. Желудочные биопсии каждого экспериментального животного раздела В также культивировали в чашках с ВН агарозой с описанными выше добавками для обнаружения Н. . После 3-10 дней инкубации в микроаэрофильных условиях присутствие Н.подтверждали окрашиванием на грамотрицательный или грамположительные бактерии и определением уреазной активности. Поскольку наблюдали значительную корреляцию при детектировании культур Н.в первой серии экспериментов (табл. 3), то для обнаружения Н.в эксперименте, описанном в разделе С, проводили только уреазные тесты желудочных биопсий. Обнаружение Н.подтверждалось микроскопией двумя независимыми исследователями с применением двух разных красителей (акридинового оранжевого и крезилового фиолетового). Пробы крови коагулировали в течение 3 ч при(комнатной температуре), собирали сыворотки и замораживали их при -20 С до проведения анализа. Кишечные инфекции откручивали в течение 5 мин при 4 С для 8 3684 1 удаления остатков клеток и хранили замороженными при -20 С. Затем пробы сыворотки и кишечные пробы каждого животного анализировали при помощидля оценки активности противсогласно стандартным процедурам. Вкратце пластинки с 96 ячейками покрывали гомогенатом, полученным после обработки клеток Н.ультразвуком с последующим насыщением 5 обезжиренным молоком. Пробы сериально разбавляли от 11 до 11000 и инкубировали в течение ночи при 4 С на пластинках . Биотинилированныепротив мышей (сыворотка) и , обработанные затем стрептавидином - пероксидазой хрена, были использованы для определения уровней антител. Результаты введений Н.после иммунизаций очищенной уреазы Н.представлены в табл. 1-3 и фиг. 1-4, а результаты введения Н.после иммунизации субъединицами А и В рекомбинантной уреазы Н.представлены в табл. 4-6 и фиг. 5 и 6. В табл. 1, относящейся к эксперименту, описанному в разделе В, ч обозначает часы,обозначает иммуноглобулин,обозначает не определяли, уреазаН обозначает, что мышей иммунизировали уреазой (соединенной с гидроксиапатитом и холерным токсином) и затем заражали Н. , уреаза обозначает, что мышей иммунизировали уреазой (соединенной с гидроксиапатитом и холерным токсином) и не заражали,СТ обозначает, что мышей ложно иммунизировали холерным токсином и заражали Н. ,обозначает, что мышей иммунизировали гомогенатом, полученным при обработке клеток Н.ультразвуком, с холерным токсином и заражали Н. ,обозначает, что мышей иммунизировали гомогенатом, полученным обработкой клеток Н.ультразвуком, с холерным токсином и не заражали. В табл. 1 числа для результатов с антителами даются как измерение поглощения при 595 нм, умноженное на 1000. Измеренный фон в отсутствие антител вычитали. Результаты эксперимента, описанного в разделе В, полученные на основе уреазы тестов желудочных биопсий и грам-окрашивания культур Н. , представлены в табл. 2. Инфекцию определяли с применением одного или нескольких маркеров колонизации Н. , в том числе при помощи уреазного теста или грамокрашивания культур. Из результатов, представленных в табл. 1 и 2, видно, что при пероральной иммунизации уреазой Н.по сравнению с вариантами, в которых вводили либо гомогенат, полученный обработкой клеток Н.ультразвуком, либо холерный токсин, получали статистически значимую защиту против заражения Н. . Как видно из табл. 2, из 10 иммунизированных животных только 3 инфицировались, по сравнению с 6 животными, иммунизированными гомогенатом клеток Н. , полученными при обработки ультразвуком, и 9 животными, иммунизированными холерным токсином. Табл. 2 показывает, что 70 животных были защищены от заражения Н.по сравнению с 33 животных, иммунизированных гомогенатом клеток при обработке ультразвуком, и 10 животных, иммунизированных холерным токсином и подвергнутых затем введению Н. . Другими словами, 90 контрольных мышей, экспонированных с Н. , были инфицированы патогеном, тогда как у мышей, иммунизированных уреазой Н.за 28 дней до экспозиции с Н. , скорость инфицирования была только 30 . Это означает значительное снижение заражения (р 0,0198 в точном тесте Фишера по сравнению с контрольными мышами). При пероральной иммунизации мышей гомогенатом клеток Н. , полученным при обработке клеток ультразвуком, скорость инфицирования была 67(незначительно отличалась от контроля). Защита, полученная с применением уреазы Н. , была неожиданной и не могла быть предсказана на основании результатов, наблюдаемых при использовании гомогената клеток Н. , полученного при обработке клеток ультразвуком. Фиг. 1 представляет графически результаты тестов на антитела в сывороткеи кишечной секреции у мышей, не защищенных после иммунизации уреазой. Эти мыши соответствуют нормам 1, 4 и 6 в табл. 1 и составляют группу А Фиг. 2 показывает ответ в виде образования антител у мышей, которые были защищены после иммунизации уреазой (группа В), т.е. мышей 2, 3, 5 и 7-10. Фиг. 3 и 4 относятся к результатам, полученным с мышами 31-39. Фиг. 3 (группа С) изображает образование антител у мышей, не защищенных после иммунизации гомогенатом Н.(номера мышей 31, 32,33, 35, 36 и 38). Фиг. 4 (группа ) изображает образование антител у мышей, защищенных после иммунизации гомогенатом Н.(номера мышей 34, 37 и 39). Интересно отметить в отношении фиг. 3 и 4, что обозначениеантител (но не ) выше у мышей защищенных, чем у незащищенных мышей, что предполагает корреляцию между защитой и образованиемантител. Образованиене обнаруживает подобной корреляции. Как известно,слизистой оболочки, а несыворотки играют роль в защите против бактериальных инфекций кишечника. Результаты корреляции между детектированием Н.в желудочных биопсиях при помощи уреазных тестов и при помощи культур представлены в табл. 3. Табл. 3 показывает, что существует очень значительная корреляция между результатами уреазных тестов,проведенных на желудочных биопсиях, и идентификацией Н.в культурах В дальнейших экспериментах предпочтение отдавали уреазным тестам для диагностики инфекции Н.в мышах вследствие большей чувствительности этих тестов. Этот подход позволил проводить уреазные тесты с большими фрагментами желудка каждой мыши и увеличить далее чувствительность уреазного теста. Кроме того, применение спосо 9 3684 1 ба с наивысшей чувствительностью предохраняет от завышенной оценки защиты, полученной с испытуемыми препаратами. При использовании положительной культуры в качестве стандарта инфицированная защита, индуцированная после иммунизации уреазой во время эксперимента, представленного в разделе В, также значительна, как при применении сочетания уреазного теста и культуры (р 0,021 против р 0,019). Результаты экспериментов, описанных в разделе С (субъединицы рекомбинантной уреазы), полученные на основании уреазных тестов желудочных биопсий, представлены в табл. 1, 5 и 6 и изображены на фиг. 6. В табл. 4 СТ обозначает холерный токсин, - обозначает субъединицу А уреазы Н. ,обозначает субъединицу В уреазы Н.и НАР обозначает кристаллы гидроксиапатита. Мышей 20-54 убивали через 12 дней после инфицирования, а мышей 68-82- через 10 недель (106 дней) после инфицирования. Результаты уреазного теста, проведенного на биопсиях желудка каждого животного,представлены в виде величинпри 550 нм. Знакии - обозначают конечное состояние инфекции каждого животного в соответствии с положительным или отрицательным уреазным тестом для обнаружения Н. . Положительная реакция соответствует 5500,2. Из результатов, представленных в табл. 4, 5 и 6, видно, что статистически значимую защиту против инфицирования Н.получали при пероральной иммунизации. В субъединицей рекомбинантной уреазы Н.по сравнению с защитой, полученной с применением либо субъединицы А Н. , либо холерного токсина. Из табл. 4 видно, что через 12 дней после инфицирования из 10 иммунизированных животных только 3 были инфицированы в группе с субъединицей В уреазы по сравнению с 10 животными, иммунизированными субъединицей А уреазы Н. , и 10 из 10 животных, иммунизированных холерным токсином. Табл. 4 показывает, что 70 животных были защищены от инфицирования Н.по сравнению с 0 животных, иммунизированных субъединицей А Н.и 0 животных, иммунизированных холерным токсином и затем подвергнутых инфицированию Н. . Другими словами, 100 контрольных мышей, инфицированных Н. , заражались, тогда как у мышей, иммунизированных субъединицей В рекомбинантной уреазы Н. , скорость (коэффициент) инфицирования была только 30 . Это свидетельствует о значительном снижении инфицирования (р 0,0031, точный тест Фишера) по сравнению с контрольными мышами. Тот факт, что защита, наблюдаемая при применении уреазы Н. , полностью зависела от иммунизации субъединицей В уреазы и субъединица А не давала такого эффекта, не был предсказуем на основании этого эксперимента с очищенной уреазой. Следовательно, это определение роли 2 структурных субъединиц уреазы в развитии защитного иммунного ответа является новым. Защита, полученная с применением субъединицы В рекомбинантной уреазы, которая ферментативно неактивна, свидетельствует также о том, что нетоксичные формы уреазы могут быть использованы в качестве пероральной вакцины против инфекции . Кроме того, эти результаты являются сильным свидетельством в пользу того, что для защиты не требуется узнавание активного сайта, поскольку едва ли можно думать, что неактивная субъединица В уреазы способна индуцировать антитела, которые будут узнавать и ингибировать каталитический сайт нативной уреазы. Из табл. 6 видно, что в случае, когда мышей убивали через 10 недель после инфицирования, 60(6 мышей из 10) животных, иммунизированных субъединицей В уреазы, и 80(4 мыши из 5) животных, иммунизированных субъединицей В Н. , были защищены против инфекции Н. . Тот факт, что защита, полученная иммунизацией субъединицей В уреазы, сохраняется с течением времени и что иммунизация субъединицей А уреазы вызывает защиту, которая исчезает со временем по сравнению с защитой, вызываемой субъединицей В уреазы, был неожиданным после нашего эксперимента с очищенной уреазой или других проведенных ранее экспериментов. Факт, что иммунизация субъединицей В уреазы вызывает защиту,определенно доказывает, что для защиты не требуется узнавания активного сайта. Фиг. 6 суммирует результаты, полученные после пероральной иммунизации субъединицами А и В рекомбинантной уреазы (описанные в табл. 5 и 6). Данное изобретение также обеспечивает композиции вакцин, пригодные для профилактики инфекции. Эти композиции содержат эффективное количество антигена уреазы, предпочтительно субъединиц уреазы Н.или рекомбинантной уреазы Н. , способного индуцировать в хозяине защитный иммунный ответ на инфекцию , в соединении с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Вакцины вводят в количествах, легко определяемых лицами с обычной квалификацией в этой области. Так, для взрослых подходящая доза лежит в диапазоне 10 мкг - 100 мг, например 50 мкг - 50 мг. Близкие диапазоны доз применимы для детей. Системы носителя могут представлять собой капсулы с высвобождением активного компонента в желудке, защищающие антиген от кислой среды в желудке и содержащие антиген уреазы в нерастворимой форме в виде слитых белков. Вакцина может вводиться в качестве первичного профилактического средства для взрослых и детей, в качестве вторичного профилактического средства, после успешной ликвидации Н.в инфицированном хозяине или в качестве терапевтического средства с целью индуцирования иммунного ответа в хозяине для уничтожения Н. . 3684 1 Как отмечалось выше, подходящим адъювантом для слизистой оболочки является холерный токсин. Можно использовать также мурамилдипептид или его производные, нетоксичные производные холерного токсина, в том числе его В-субъединицу, и/или конъюгаты или генетически сконструированные слияния (спитые белки) антигена уреазы с холерным токсином или его В-субъединицей. Другими подходящими средствами доставки являются биодеградируемые микрокапсулы или иммуностимулирующие комплексы ( ) или липосомы,генетически сконструированные ослабленные живые векторы, такие, как вирусы или бактерии, и рекомбинантные (химерные) подобные вирусу частицы, например вирусу блутанга (синего языка). Количество адъюванта слизистой оболочки зависит от типа этого адъюванта. Например, в случае холерного токсина его применяют в количестве 5 мкг - 50 мкг, в частности 10 мкг - 35 мкг. В случае микрокапсул применяемое количество будет зависеть от количества, применяемого в матриксе микрокапсул для достижения желаемой дозы. Определение этого количества вполне доступно лицам с обычной квалификацией в этой области. Пригодными носителями для вакцин данного изобретения являются желудочные капсулы с покрытием и поликислотные-гликолидные микросферы. В качестве разбавителей пригодны 0,2 3 и/или солевой (физиологический) раствор. Гидроксилированный фосфат кальция (НСР) в виде частиц особенно применим в качестве носителя для уреазы Н.для нанесения на поверхность слизистой оболочки. Считается, что конъюгат уреазы Н.с гидроксилированным фосфатом кальция транспортируется через эпителий, где он вызывает иммунный ответ в виде образования поли - . Предпочтительно применение гидроксилированного фосфата кальция в форме микрочастиц, пригодных для транспорта через эпителий, в частности клетками, специализированными для этой цели (М-клетками). Предпочтительной формой гидроксилированного фосфата кальция является гидроксиапатит, коммерчески доступный кристаллический фосфат кальция Са 10(РО 4)6(ОН)2. Коммерческий гидроксиапатит обычно состоит из стержнеподобных кристаллов, которые химически и физически аналогичны неорганическому гидроксиапатиту в нормальной костной ткани. Поэтому прием внутрь гидроксиапатита является безопасным, что подтверждается существованием пищевых кальцийфосфорных добавок, получаемых из размолотых костей и предназначенных для глотания. Коммерческий очищенный гидроксиапатит (из) состоит из кристаллов, широко варьирующих по размеру. Кристаллы длиной более 1 мкм, вероятно, не поглощаются М-клетками. Поэтому для применения в данном изобретении кристаллы коммерческого гидроксиапатита разбивают на небольшие, относительно однородные кристаллические фрагменты, например, разрушением ультразвуком. Предпочтительно основная часть гидроксиапатита присутствует в виде фрагментов приблизительно 0,01-0,0 мкм. Фрагментация может быть изменена либо при помощи электронной микроскопии, либо по рассеиванию света обычными способами. Предпочтительными способами введения антигена Н.является пероральный, назальный, ректальный и глазной способы. Пероральный способ введения может обеспечить доставку к слизистой оболочке не только желудка, но и кишечника. Вакцины данного изобретения можно вводить к поверхности слизистой оболочки в форме аэрозоля, суспензии, капсулы и/или суппозитория. Способ введения легко определяют лица с обычной квалификацией в этой области. Данное изобретение предусматривает также пассивную иммунизацию млекопитающих, в том числе человека, против инфекции . Это достигается введением к поверхности слизистой оболочки больного эффективного количества специфических для уреазы антител, предпочтительномонокпональных антител, специфических для Н. . Поскольку уреаза Н.представляет антиген, участвующий в индуцировании защитного иммунитета,дальнейшим аспектом данного изобретения является применение уреазы Н.в качестве диагностического реагента для измерения иммунного ответа лиц, получивших вакцину на основе уреазы, или для определения иммунности или восприимчивости (т.е. необходимости вакцинации) индивидуума. Данное изобретение также предусматривает применение уреазы или специфических для уреазы антител для составления реакционных смесей и наборов (китов) для диагностики иммунитета к инфекции , оценки восприимчивости к инфекциии определения иммунного ответа на вакцину. Примеры. Далее изобретение будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие изобретение примеры. а) Бактериальные штаммы Н.был получен у(, ., . ). Н.был выделен из больных с язвенными заболеваниями (, ,).) Бактериальные культуры Жидкая культура - бактерии культивировали на(, ) жидкой среде, содержащей 0,25 дрожжевого экстрактаи 10 эмбриональной сыворотки теленкас добавлением 0,4 выбранного комплемента. Бактерии инкубировали в течение ночи при микроаэрофильных условиях при 37 С и затем качали при 37 С в течение 2-3 дней. Культура на агарозных чашках - бактерии культивировали на агарозных чашках, содержащих , 0,25 дрожжевого экстракта и 50 овечьей крови, при микроаэрофильных условиях в течение 3 дней при 37 С. 3684 1 Определение количества бактерий - количество бактерий определяли по оптической плотности растворапри 660 нм (1 единица оптической плотности соответствует 108 бактерий). с) Приготовление гомогентов разрушенных ультразвуком клеток Н.собирали из 31 чашки, содержащих агарозу с кровью в 0,15 Ми откручивали 5 мин при 1400 при 4 С. Остаток ресуспендировали в 3 мли обрабатывали звуком (озвучивали в течение 4 мин. Количество белка определяли по Бредфорду / в соответствии с поставщиком).) Соединение иммуногена с гидроксиапатитом Иммуноген (уреазу или ее субъединицу) инкубировали в течение часа при 4 С с гидроксиапатитом. 1,0 г гидроксиапатита применяли для 30 мкг иммуногена на мышь. В конце инкубирования добавляли 10 мкг холерного токсина в конечном объеме 200 мкл . Пример 1. а) Экстракция Н.из 30 чашек с кровью и агаром собирали в 0,15 Мна льду. Раствор откручивали 5 мин при 1400 при 4 С. Осадок ресуспендировали в 20 мл Н 2 О и откручивали 45 с при максимальной скорости. Затем экстракт откручивали 20 мин при 6700 при 4 С. Супернатант извлекали и оценивали количества белка(см. выше), после чего осаждали 70 -ным сульфатом аммония.) Очистка уреазы Раствор хроматографировали на колонке-6 с(физиологический раствор с фосфатным буфером) в качестве подвижной фазы. 22 собранные фракции, которые обнаружили активную уреазную активность, соединяли вместе и диализировали в течение ночи при 4 С против 3 л РЕВ (20 нМ фосфатный буфер, рН 7) и затем хроматографировали нас РЕВ в качестве подвижной фазы. Фракции элюировали при помощи градиента 0-500 нМ . 10 собранных фракций с сильной уреазной активностью отдельно наносили на гель с - с последующим окрашиванием Кумасси. 6 фракций обнаружили 2 отдельные полосы, соответствующие мол. массам 63 и 28 КДа. Эти фракции соединяли и рассматривали как очищенную уреазу. Пример 2 (см. также раздел В). Мышей, применяемых в исследовании иммунизации, подвергали легкой анестезии эфиром перед внутрижелудочной иммунизацией. Затем озвученный препарат или очищенную уреазу, гидроксиапатит и холерный токсин суспендировали ви 200 мкл доставляли в желудок соответствующих мышей при помощи полиэтиленовой трубки, соединенной со шприцем для подкожных инъекций. Этот способ назван пероральной иммунизацией. Оценивались протоколы трех пероральных иммунизаций. Они описаны ниже. Протокол В 1 - вакцинация очищенной уреазой. Самок / шестинедельных мышей (20) перорально иммунизировали 30 мкг очищенной уреазы Н.и 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0,7, 14 и 21 дни. 10 мышей инфицировали на 28 и 30 дни 5107 и 108 Н.из жидкой культуры. Протокол В 2 - вакцинация озвученными гомогенатами Не. Самок / шестинедельных мышей (20) перорально иммунизировали 2 мг раствора после обработки ультразвуком клеток Н.на 0,7, 14 и 21 дни. 10 мышей инфицировали на 28 и 30 дни 5107 и 108 Н. . Протокол В 3 контроль. Самок / шестинедельных мышей (20) перорально иммунизировали 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0,7, 14 и 21 дни. Мышей инфицировали на 28 и 30 дни 5107 и 108 Н. . На 35 день мышей убивали и были взяты биопсии из желудка, а также кишечные секреции и кровь. Защита и оценка. Для оценки защиты биопсии скринировали на уреазную активность при помощи теста() в соответствии с инструкциями поставщика. Уреазу определяли количественно путем спектрофотометрического измерения при 550 нм. Затем биопсии культивировали в присутствии Н.и оценивали по грам-окрашиванию. Биопсии полости желудка гомогенизировали и разбавляли (1100 и 11000) в 0,15 Ми высевали в чашки с кровью и агаром и инкубировали при микроаэрофильных условиях при 37 С в течение 4-10 дней.(твердофазный иммуноферментный анализ). Кишечные секреции и кровь анализировали при помощидля оценки титра антител. Анализ проводили следующим образом. Планшеты из полистирола (96 ячеек) покрывали 1 мкг/ячейку очищенной уреазой при 37 С в течение 2 ч. Сайты неспецифического связывания блокировали 5 -ным порошкообразным молоком в- 0,1 при 37 С в течение 30 мин. Планшеты промывали один раз- 0,1. Пробы крови тестировали при разведении 1100, а кишечные секреции при разведении 11. 100 мкл каждой пробы добавляли к покрытым антигеном планшетам. После 2 ч инкубации планшеты промывали 3 раза- 0,1. Антимышиные биотинилированные целые антитела из козы и антимышиные биотинилированные ,идобавляли (100 мкл) при разбавлении 1500, за исключением(1250),и инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Планшеты промывали 3 раза- 0,1, добавляли 100 мкл 12 3684 1 разведения 11000 стрептавидин-пероксидазы хрена в- 0,1 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. Планшеты промывали 3 раза, добавляли 50 мкл разведения 150 о-фенилдиамина в цитратном буфере рН 5,0 с 1 мкл/мл 30 -ной Н 2 О 2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. В каждой ячейке определяли поглощение при 495 нм. Пример 3 (см. также раздел С). Мышей, применяемых в исследованиях по иммунизации, подвергали легкой анестезии эфиром перед внутрижелудочной иммунизацией. Затем 30 мкг субъединиц А и В рекомбинантной уреазы Н. , продуцировали в Е , связанной с гидроксиапатитом и дополненной холерным токсином, суспендировали ви 200 мкл доставляли в желудок соответствующих мышей при помощи полиэтиленовой трубки, соединенной со шприцем для подкожных инъекций. Эту процедуру называют пероральной иммунизацией. Оценивали протоколы трех пероральных иммунизаций. Протоколы описаны ниже. Протокол С 1 - вакцинация субъединицей А рекомбинантной уреазы. Самок / шестинедельных мышей (10) перорально иммунизировали 30 мкг очищенной субъединицы А рекомбинантной уреазы Н.и 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0,8, 14 и 21 дни. 10 мышей инфицировали на 32, 34 и 36 дни 108 Н.из жидкой культуры. Протокол С 2 - вакцинация субъединицей В рекомбинантной уреазы. Самок / шестинедельных мышей (10) перорально иммунизировали 30 мкг очищенной субъединицы В рекомбинантной уреазы Н.и 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0,8, 14 и 21 дни. Мышей инфицировали на 32, 34 и 36 дни 108 Н.из жидкой культуры. Протокол С 3 контроль. Самок / шестинедельных мышей (10) перорально иммунизировали 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0,8, 14 и 21 дни. Мышей инфицировали на 32, 34 и 36 дни 108 Н. . На 42 106 день мышей убивали и брали множество биопсий их желудка. Защита и оценка. Для оценки защиты биопсии корпуса и полости желудка скринировали на уреазную активность при помощи тестаНВ ( ) в соответствии с инструкциями поставщика. Уреазу определяли количественно путем спектрофотометрического измерения при 55 нм. Тотальные величиныкорпуса и полости желудка складывали для получения конечной величиныдля каждой мыши. Таблица 1 Мышь Номер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Тест на уреазу 12 ч Иммуногобулины Сыворотка Кишечная секр. Тест на уреазу 12 ч 0 0 0 0 Иммуногобулины Сыворотка Кишечная секр. Таблица 2 защищенных мышей Уреза Н. 3/10(30 ) 7/10(70)х Гомогенат при обработке ультразвуком Н. 6/9(66 ) 3/9(33 )хх СТ Н. 9/10(90 ) 1/10(10 ) х 0,0198 (двусторонний точный тест Фишера) по сравнению с контролем СТ (холерный токсин). хх р 0,303 (двусторонний точный тест Фишера)по сравнению с контролем СТ (холерный токсин). Иммунизация Таблица 3 Уреазный тестКультура Н.16 Культура Н. 2 Всего 18 Двусторонний точный тест Фишера р 0,0001. Защита, измеренная через 12 дней после инфицирования Иммунизация Инфицированиеинфицированных Субъединица А урзы Н. 10/10(0 ) Субъединица В урезы Н. 30/10(30 ) СТ Н. 10/10(100 ) х 0,0031 (двусторонний тест Фишера) по сравнению с контролем СТ. 3684 1 Таблица 6 Защита, измеренная через 10 недель после инфицирования Иммунизация Инфицированиеинфицированных Субъединица А урзы Н. 1/5(20 ) Субъединица В Н. 4/10(40 ) х р 0,003 (двусторонний тест Фишера) по сравнению с контролем СТ. хх р 0,01 (двусторонний тест Фишера) по сравнению с контролем СТ. Фиг. 6 Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 16

МПК / Метки

МПК: G01N 33/573, C12N 9/78, G01N 33/569, C12N 15/55, C07K 15/04, A61K 39/106

Метки: иммунного, инфекцию, защиты, млекопитающих, способ, helicobacter, индуцирования, вакцина, ответа, против, пассивной, инфекции, защитного

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/16-3684-sposob-inducirovaniya-u-mlekopitayushhih-zashhitnogo-immunnogo-otveta-na-infekciyu-helicobacter-vakcina-dlya-inducirovaniya-zashhitnogo-immunnogo-otveta-na-infekciyu-helicobacter-u.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ индуцирования у млекопитающих защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter, вакцина для индуцирования защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter у млекопитающих, способ индуцирования пассивной защиты у млекопитающих против инфекции</a>

Похожие патенты