Двухслойные фосфолипидные везикулы и способ их получения

Номер патента: 3634

Опубликовано: 30.12.2000

Авторы: ГЛЮК РАЙНХАРД, КЛЯЙН ПЕТЕР, ХЕРМАНН ПЕТЕР

Есть еще 4 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ДВУХСЛОЙНЫЕ ФОСФОЛИПИДНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель НИКА ХЕЛТ ПРОДАКТС ЛИМИТИД(73) Патентообладатель НИКА ХЕЛТ ПРОДАКТС ЛИМИТИД(57) 1. Двухслойные фосфолипидные везикулы, включающие, по крайней мере, один функционально активный вирусный слитый пептид и, по крайней мере, один специфический для клеток маркер на мембране, содержащие необходимое лекарственное средство или фармацевтически активное вещество, отличающиеся тем, что фосфолипиды включают экзогенный фосфотидилэтаноламин и фосфотидилхолин, предпочтительно в смеси с вирусными фосфолипидами и произвольно вместе с холестерином по меньшей мере, один функционально активный слитый пептид выбирают из группы, включающей тример или мономер гемагглютинина, гликопептиды НА 1 и НА 2, слитые пептиды, выделенные из природного материала, или синтетические слитые пептиды 3634 1 они дополнительно включают поперечносвязывающий агент, представляющий собой бифункциональную органическую молекулу, предпочтительно сукцинимидил производное, которая связывает один связывающий сайт, предпочтительно карбоксильную группу, с фосфотидилэтаноламином мембраны, а другой связывающий сайт, предпочтительно тиоловую или малеиновую группу, со специфическим для клеток маркером,и по меньшей мере, один специфический для клеток маркер представляет собой белок, способный связываться с рецептором клетки, предпочтительно моноклональное антитело. 2. Везикулы по п. 1, отличающиеся тем, что содержание холестерина в них не превышает 10 вес. , предпочтительно не более 1 вес. . 3. Везикулы по п. 1 или 2, отличающиеся тем, что их диаметр не превышает 100 нм, предпочтительно равен 80 нм. 4. Везикулы по любому из пп. 1-3, отличающиеся тем, что специфические для клеток маркеры представляют собой моноклональноеантитело. 5. Везикулы по любому из пп. 1-4, отличающиеся тем, что гемагглютинин получен, по крайней мере, из одного члена, выбранного из группы, включающей вирус гриппа, предпочтительно подтипа -11, рабдовирус, вирус парагриппа типа , вирус комариной лихорадкии тогавирус. 6. Везикулы по любому из пп. 1-3, отличающиеся тем, что специфические для клеток маркеры содержат, по меньшей мере, один слитый пептид в форме последовательности аминокислот, по меньшей мере,один конец которой образован не менее чем одной цистеиновой группой, предпочтительно тремя цистеиновыми группами. 7. Везикулы по любому из пп. 1-6, отличающиеся тем, что они содержат вирусные фосфолипиды, по меньшей мере, из одного члена группы, включающей вирус гриппа, предпочтительно подтипа А-Н 11, рабдовирус, вирус парагриппа типа , вирус комариной лихорадкии тогавирус. 8. Везикулы по любому из пп. 1-7, отличающиеся тем, что они содержат вирусные фосфолипиды в сочетании с экзогенным фосфотидилхолином в количестве от 2 до 100, предпочтительно от 5 до 15 частей. 9. Везикулы по любому из пп. 1-8, отличающиеся тем, что содержание фосфотидилхолина в мембранах составляет 70-95 по весу от общего содержания фосфолипидов, а содержание фосфатидилэтаноламина - 530 , предпочтительно 10-20 от общего веса фосфолипидов. 10. Везикулы по любому из пп. 1-9, отличающиеся тем, что содержание поперечносвязывающего агента составляет от 5 до 10 , предпочтительно от 6 до 8 по весу относительно всей мембраны. 11. Везикулы по любому из пп. 1-10, отличающиеся тем, что они содержат, по меньшей мере, одно из следующих веществ имидазолкарбоксамид, гидроксимочевину, адрибластин, эндоксан, фторурацил, колхицин, декстрансульфат, димер рибонуклеазы, димер лизоцима. 12. Везикулы по любому из пп. 1-11, отличающиеся тем, что они используются для приготовления лекарственных средств против раковых опухолей или СПИДа. 13. Способ получения двухслойных фосфолипидных везикул по п. 1, включающий растворение фосфолипидов в неионном детергенте, предпочтительно вместе с, по меньшей мере, одним слитым пептидом, добавление требуемого лекарственного средства или фармацевтически активного вещества, удаление детергента,придание везикулам желаемого размера и связывание со специфическими для клеток маркерами, отличающийся тем, что очищенный вирус или его поверхностные антигены растворяют в неионном детергенте, содержащем монододециловый эфир октаэтиленгликоля (ОЕ), который не взаимодействует с гемагглютинином, после чего полученную суспензию подвергают ультрацентрифугированию и отбирают супернатант для последующей обработки к супернатанту, содержащему вирусные липиды и, по меньшей мере, один слитый пептид, добавляют требуемое лекарственное средство и фармацевтически активное вещество полученную смесь объединяют с невирусными фосфолипидами, содержащими фосфотидилхолин и фосфотидилэтаноламин двухслойные фосфолипидные везикулы получают посредством удаления детергента при помощи повторной обработки раствора гранулами микроносителя, предпочтительно полистироловыми гранулами полученные двухслойные фосфолипидные везикулы подвергают ультразвуковой обработке для придания им нужного размера полученные фосфолипидные везикулы обрабатывают раствором, содержащим бифункциональный поперечносвязывающий агент, представляющий собой органическую бифункциональную молекулу, предпочтительно сукцинимидил производное, которая связывается с фосфотидилэтаноламином мембраны везикулы посредством одного связывающего сайта, предпочтительно карбоксильной группы полученные фосфолипидные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по меньшей мере, один специфический для клеток маркер, предпочтительно антитело, которое связывается с другим связывающим сайтом, предпочтительно тиоловой или малеиновой группой бифункционального поперечносвязывающего агента либо требуемое лекарственное средство или фармацевтически активное вещество растворяют в растворе не 2 3634 1 ионного детергента, содержащего монододециловый эфир октаэтиленгликоля (ОЕ), который не реагирует с гемагглютинином полученный раствор объединяют с невирусными фосфолипидами, включающими фосфотидилхолин и фосфотидилэтаноламин двухслойные фосфолипидные везикулы получают посредством удаления детергента при помощи гранул микроносителя, предпочтительно полистироловых гранул полученные везикулы подвергают ультразвуковой обработке для придания им нужного размера полученные везикулы обрабатывают раствором, содержащим бифункциональный поперечносвязывающий агент, представляющий собой органическую бифункциональную молекулу, предпочтительно сукцинимидил производное, которая связывается с фосфотидилэтаноламином мембраны везикулы посредством одного связывающего сайта, предпочтительно карбоксильной группы полученные фосфолипидные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по крайней мере, один синтетический слитый пептид и специфический для клеток маркер, предпочтительно антителом, которое связано с другим связывающим сайтом, предпочтительно тиоловой или малеиновой группой указанного бифункционального поперечносвязывающего агента. 14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что раствор детергента имеет концентрацию от 10 до 250 мкМ,предпочтительно от 80 до 120 мкМ ОЕ на мл. 15. Способ по п. 13 или 14, отличающийся тем, что раствор детергента удаляют посредством повторной его обработки, предпочтительно трехкратной или четырехкратной, гранулами микроносителя в количестве 1-2 г, предпочтительно примерно 1,5 г на 100 мг детергента, причем гранулы указанного микроносителя имеют размер во влажном состоянии приблизительно 20-50 меш (соответствующий размерам пор 0,3-0,84 мм). 16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что вирусные липиды и/или слитые пептиды получают из вируса, выбранного из группы, включающей вирус гриппа, рабдовирус, вирус парагриппа типа, вирус комариной лихорадкии тогавирус. 17. Способ по любому из пп. 13-16, отличающийся тем, что указанные специфические для клеток маркеры содержат, по меньшей мере, одноантитело. 18. Способ по любому из пп. 13-17, отличающийся тем, что бифункциональный поперечносвязывающий агент связан с мембраной везикул в количестве, составляющем приблизительно от 5 до 10 по весу относительно всей мембраны. 19. Способ по любому из пп. 13-18, отличающийся тем, что фармацевтически активное вещество выбирают из группы, состоящей из декстрансульфата, димера рибонуклеазы, димера лизоцима, имидазолкарбоксамида, гидроксимочевины, адрибластина, эндоксана, фторурацила и колхицина. Изобретение относится к области медицины, именно к лекарствам и медикаментам для терапевтических целей. При приеме больным того или иного лекарственного средства, оно сначала должно поступить из места введения в кровь, поэтому способ введения препарата может иметь существенное влияние на его фармакокинетический профиль в кровяном русле. Так, в случае выбора перорального способа введения, действие лекарственного средства развивается медленно, а его оптимальная концентрация в крови достигается не всегда. Напротив,при внутривенном введении концентрация препарата в крови носит предсказуемый характер и достаточно быстро достигает требуемой величины, хотя такой способ связан с известными неудобствами для больного и болезненными ощущениями. Но, даже при непосредственном введении медикаментов в системный кровоток,взаимосвязь между введенной дозой, концентрацией препарата в крови и продолжительностью его действия на орган-мишень носит весьма сложный характер. Значения этих параметров определяются сложной системой обмена, нередко имеющих конкурентный характер, который в конечном итоге приводит либо к накоплению активных молекул в ткани-мишени, либо к инактивации и экскреции лекарственного средства. К числу таких путей относятся биотрансформация в печени и других органах, введение через почки или с желчью, связывание препарата с фиксированными или циркулирущими клетками и макромолекулами, пассивное или с помощью других соединений проникновение через мембранные барьеры (, (1979),,). 3 3634 1 В последние годы заметен большой интерес к перспективам регуляции распределения и обмена лекарственных средств в организме по наиболее благоприятному для больного сценарию посредством применения различного рода носителей или систем введения медикаментозных препаратов. Такие системы предназначены для контроля одного или нескольких следующих параметров (, (1975), Сап. . .56, 683-690) а) скорости включения препарата в определенную ткань организма,б) распределения и локализации лекарственного средства в организме больного,в) устойчивости и скорости превращения препарата. Важным вкладом в разработку систем направленного введения лекарственных средств явилось конструирование липосом, впервые описанное , , , М.М., (1965), . . . 13, 238252). К настоящему времени в литературе имеются многочисленные описания достоинств методики введения лекарственных средств в составе липосом. Эти способы можно с известной долей условности подразделить на следующие категории 1. Липосомы могут проникать через биологические мембраны и способствовать транспорту медицинских препаратов через обычно непроницаемые для последних барьеры. В частности, заключенные в липосомы соединения могут доставляться внутрь клеток. 2. Липосомы могут быть предназначены для взаимодействия с определенными тканями, с целью повышения избирательности действия лекарственных препаратов и снижения их токсического эффекта. 3. Использование липосом позволяет желаемым образом изменять фармакокинетику лекарственных средств,влияя на освобождение, распределение и выведение последних в системном кровотоке. 4. Липосомы могут применяться для предотвращения инактивации химически или метаболически лабильных соединений. Таким образом, можно отбирать соединения, перспективные с точки зрения терапевтического применения, поскольку инкапсулированные препараты обладают, по крайней мере при испытаниях, измененными, по сравнению с исходными свойствами. К сожалению, первые надежды на революционизирующие последствия нового подхода к химиотерапии полностью не оправдались, как об этом свидетельствуют результаты экспериментальных исследований (, (1981), ..(.), /-). Более обнадеживающие результаты при использовании липосом в качестве переносчиков лекарственных средств могут быть получены при нагрузке липосом специфическими белками. Для того, чтобы обеспечить более надежную доставку заключенных в липосомы препаратов к нужным органам или тканям, методика нагрузки должна быть направлена на предотвращение задержки липосом в нежелательных местах (таким образом, снижается токсичность) и оптимизацию переноса лекарственного средства в определенные типы клеток(для усиления требуемого эффекта). Некоторые исследователи покрывали липосомы оболочкой из агрегированных иммуноглобулинов для оптимизации их доставки на фагоциты (, ., , , (1979), . ., 13, 769773/, , , , , ., , ., . (1980)(, , .) 255-270. /-., ). В дальнейшем методика была усовершенствована ((1975), . .. ., 65, 537-544), которые предложили более эффективный способ нагрузки липосом специфическими для определенного типа клеток антителами (иммуноглобулинами). Включение липосом, связанных с иммуноглобулинами к определенным клеточным линиям, возрастало при этом в 3-25 раз. Тем не менее, при практическом применении этого метода, выяснилось, что нагруженные таким образом липосомы не сливались с клеточными мембранами, что препятствовало эффективной доставке к клеткам заключенных в липосомах лекарственных препаратов (, . , , ., , , (1979), . . 122, 585-591). Важным шагом на пути улучшения способов получения систем введения лекарственных средств явилось связывание липосом с вирусными белками. Мембраны липосом, согласно этому способу, подвергают модификации такими белками, как гемагглютинин вируса гриппа (, , , С.М., , , (1975),2, 899-901). Эффективность и специфичность взаимодействия вируса с клетками-хозяевами на его ранних стадиях (адсорбция, проникновение в клетки) поддаются регуляции посредством включения соответствующих вирусных белков в мембраны липосомных носителей. Например, включение поверхностных белков вирусав двуслойную липосому, по меньшей мере, в 100 раз усиливает включение фрагмента А токсина дифтерии мышиными -клетками по сравнению с наблюдающимися при использовании липосом, содержащих фрагмент А в отсутствие вирусных белков (, Т., , ., , ., , .,. (1979). . . 80, 10-20). Основным недостатком описанной методики является отсутствие полноценно активных слитых пептидов гемагглютинина вируса гриппа. Вирус гриппа А проникает в клетки-хозяева в процессе слияния с мембраной. После связывания на поверхности клетки вирусные частицы проникают в нее и переносятся на эндосомы и лизосомы. Кислая среда этих органелл активизирует процесс слияния мембранных компонентов вируса 4 3634 1 и клетки-хозяина. Преимущество слияния липосом с клеткой при низких величинах рН состоит в том, что содержимое везикул освобождается после их проникновения в клеточную цитоплазму (рН среды эндосом приближается к 5,2). Открытие слияния гликопротеинов вируса гриппа при низких значениях рН породило множество попыток получить системы доставки лекарственных средств с применением липосом, ассоциированных с гемагглютинином вируса гриппа., К. с соавторами (, (1983), 733, 286-290) использовали везикулы с гликопротеиновыми гемагглютининами вируса гриппа в системе желточный фосфатидилхолин/фосфатидилхолин со спиновой меткой/холестерин в молярном соотношении 1,60,41. При соотношении белка и липидов в препарате 144 или 1105 моль/моль он содержал везикулы диаметром 100-300 нм при высокой плотности поверхностных выступов. Основные недостатки такого препарата сводились к следующему 1. Эндоцитоз фагоцитарными клетками угнетен вследствие высокого содержания холестерина и присутствия остаточных количеств детергента. Активность препарата даже по даннымс соавторами не превышала 66 , а при оценке новейшими, более совершенными методами составляла спустя 7 минут только 1(см. ниже пример 10). Это может объясняться тем, что использовавшийся авторами тритон Х-100 частично реагирует с гемагглютинином и полностью не удаляется в процессе диализа. 2. Для изучения роли мембранных компонентов вируса в реакции слияния следует иметь способы манипулирования этими компонентами. Для этой цели необходимо уметь выделять и формировать белки выступов вирусной оболочки, получая таким образом виросомы в полной мере способные вступать в реакцию биологического слияния. Тем не менее, несмотря на все усилияи его соавторов, им не удалось получить вирусы гриппа с оболочками, проявляющими такую биологическую активность. 3. Не удалось доказать связывание нагруженных вирусными белками липосом, несущих фармацевтически активные препараты, со специфическими типами клеток. Большинство других применявшихся методов получения вирусных оболочек с требуемыми свойствами основаны на солюбилизации вирусных мембран детергентами с последующим удалением детергента из надосадочной жидкости после осаждения внутриклеточных вирусных белков и генетического материала. Детергенты с высокой критической концентрацией мицелл, в частности октилглюкозид, можно достаточно полно удалить с помощью диализа. Методика с использованием октилглюкозида описана при работе с вирусом комариной лихорадки(, ., , . и , К. (1981), . . . 116,27-35) вирусом везикулярного стоматита(, О., , ., , и , .(1984), . . . 259, 4622-4628) вирусом гриппа (, , , К., , и , . (1980) 104, 294-302) и вирусом(, , , ., , ., , С. и ,. (1985), . . ., 149, 591-599). Однако ни в одном из этих исследований не были получены вирусные оболочки с желаемыми свойствами. Так, виросомы, полученные из , содержали белок и липиды в соотношении, которое отличалось от их соотношения в природной вирусной оболочке, а виросомы изне обладали способностью к биологическому слиянию. Еще один описанный в литературе метод состоит в отделении поверхностных выростов от оболочки вируса гриппа бромеленом. Получаемый таким способом гемагглютинин связывался с липосомами (, . А. и , . (1985), . . ., 260 (5), 2973-2981). Основным недостатком этого метода является ограниченная биологическая активность таких везикул вследствие расщепления бромеленом. Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в необходимости получения везикул, в которых требуемые лекарственные средства или фармацевтически активные соединения транспортируются на специфические клетки, такие как макрофаги, клетки-хелперы (Т 4), клетки мозга и другие клетки того или иного органа, с которыми везикулы прочно связываются, и проникают внутрь этих клеток в процессе фагоцитоза или эндоцитоза, в результате чего требуемое средство поступает сразу после эндоцитоза в цитоплазму нужных клеток. Задача достигается получением двухслойных фосфолипидных везикул, включающих, по крайней мере,один функционально активный вирусный слитый пептид и, по крайней мере, один специфический для клеток маркер на мембране, содержащих необходимое лекарственное средство или фармацевтически активное вещество, при этом фосфолипиды включают экзогенный фосфотидилэтаноламин и фосфотидилхолин, предпочтительно в смеси с вирусными фосфолипидами и произвольно вместе с холестерином по меньшей мере, один функционально активный слитый пептид выбирают из группы, включающей тример или мономер гемагглютинина, гликопептиды НА 1 и НА 2, слитые пептиды, выделенные из природного материала, или синтетические слитые пептиды они дополнительно включают поперечносвязывающий агент, представляющий собой бифункциональную органическую молекулу, предпочтительно сукцинимидил производное, которая связывает один связывающий сайт, предпочтительно карбоксильную группу, с фосфотидилэтаноламином мембраны, а другой связывающий сайт, предпочтительно тиоловую или малеиновую группу, со специфическим для клеток маркером,и, по меньшей мере, один специфический для клеток маркер представляет собой белок, способный связываться с рецептором клетки, предпочтительно моноклональное антитело. 5 3634 1 В предпочтительном варианте изобретения содержание холестерина в везикулах не превышает 10 вес. ,предпочтительно не более 1 вес. . Диаметр везикул не превышает 100 нм, предпочтительно равен 80 нм. Специфические для клеток маркеры представляют собой моноклональноеантитело. В предпочтительном варианте изобретения гемагглютинин получен, по крайней мере, из одного члена,выбранного из группы, включающей вирус гриппа, предпочтительно подтипа -11, рабдовирус, вирус парагриппа типа , вирус комариной лихорадкии тогавирус. В другом варианте специфические для клеток маркеры содержат, по меньшей мере, один слитый пептид в форме последовательности аминокислот, по меньшей мере один конец которой образован не менее чем одной цистеиновой группой, предпочтительно тремя цистеиновыми группами. В одном из вариантов везикулы содержат вирусные фосфолипиды, по меньшей мере, из одного члена группы, включающей вирус гриппа, предпочтительно подтипа А-11, рабдовирус, вирус парагриппа типа, вирус комариной лихорадкии тогавирус. В одном из вариантов везикулы содержат вирусные фосфолипиды в сочетании с экзогенным фосфотидилхолином в количестве от 2 до 100, предпочтительно от 5 до 15 частей. В другом варианте изобретения содержание фосфотидилхолина в мембранах составляет 70-95 по весу от общего содержания фосфолипидов, а содержание фосфатидилэтаноламина - 5-30 , предпочтительно 1020 от общего веса фосфолипидов. В другом варианте изобретения содержание поперечносвязывающего агента составляет от 5 до 10 ,предпочтительно от 6 до 8 по весу относительно всей мембраны. В другом варианте изобретения везикулы содержат, по меньшей мере, одно из следующих веществ имидазолкарбоксамид, гидроксимочевину, адрибластин, эндоксан, фторурацил, колхицин, декстрансульфат, димер рибонуклеазы, димер лизоцима. Везикулы используются для приготовления лекарственных средств против раковых опухолей или СПИДа. Другим объектом изобретения является способ получения двухслойных фосфолипидных везикул, включающий растворение фосфолипидов в неионном детергенте, предпочтительно вместе с, по меньшей мере,одним слитым пептидом, добавление требуемого лекарственного средства или фармацевтически активного вещества, удаление детергента, придание везикулам желаемого размера и связывание со специфическими для клеток маркерами, при этом очищенный вирус или его поверхностные антигены растворяют в неионном детергенте, содержащем монододециловый эфир октаэтиленгликоля , который не взаимодействует с гемагглютинином, после чего полученную суспензию подвергают ультрацентрифугированию и отбирают супернатант для последующей обработки к супернатанту, содержащему вирусные липиды и, по меньшей мере, один слитый пептид, добавляют требуемое лекарственное средство и фармацевтически активное вещество полученную смесь объединяют с невирусными фосфолипидами, содержащими фосфотидилхолин и фосфотидилэтаноламин двухслойные фосфолипидные везикулы получают посредством удаления детергента при помощи повторной обработки раствора гранулами микроносителя, предпочтительно полистироловыми гранулами полученные двухслойные фосфолипидные везикулы подвергают ультразвуковой обработке для придания им нужного размера полученные фосфолипидные везикулы обрабатывают раствором, содержащим бифункциональный поперечносвязывающий агент, представляющий собой органическую бифункциональную молекулу, предпочтительно сукцинимидил производное, которая связывается с фосфотидилэтаноламином мембраны везикулы посредством одного связывающего сайта, предпочтительно карбоксильной группы полученные фосфолипидные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по меньшей мере, один специфический для клеток маркер, предпочтительно антитело, которое связывается с другим связывающим сайтом, предпочтительно тиоловой или малеиновой группой бифункционального поперечносвязывающего агента либо требуемое лекарственное средство или фармацевтически активное вещество растворяют в растворе неионного детергента, содержащего монододециловый эфир октаэтиленгликоля , который не реагирует с гемагглютинином полученный раствор объединяют с невирусными фосфолипидами, включающими фосфотидилхолин и фосфотидилэтаноламин двухслойные фосфолипидные везикулы получают посредством удаления детергента при помощи гранул микроносителя, предпочтительно полистироловых гранул полученные везикулы подвергают ультразвуковой обработке для придания им нужного размера полученные везикулы обрабатывают раствором, содержащим бифункциональный поперечносвязывающий агент, представляющий собой органическую бифункциональную молекулу, предпочтительно сукцини 6 3634 1 мидил производное, которая связывается с фосфотидилэтаноламином мембраны везикулы посредством одного связывающего сайта, предпочтительно карбоксильной группы полученные фосфолипидные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по крайней мере, один синтетический слитый пептид и специфический для клеток маркер, предпочтительно антителом, которое связано с другим связывающим сайтом, предпочтительно тиоловой или малеиновой группой указанного бифункционального поперечносвязывающего агента. В предпочтительном варианте раствор детергента имеет концентрацию от 10 до 250 мкМ, предпочтительно от 80 до 120 мкМна мл. Раствор детергента удаляют посредством повторной его обработки, предпочтительно трехкратной или четырехкратной, гранулами микроносителя в количестве 1-2 г, предпочтительно примерно 1,5 г на 100 мг детергента, причем гранулы указанного микроносителя имеют размер во влажном состоянии приблизительно 20-50 меш (соответствующий размерам пор 0,3-0,84 мм). В одном из вариантов вирусные липиды и/или слитые пептиды получают из вируса, выбранного из группы, включающей вирус гриппа, рабдовирус, вирус парагриппа типа , вирус комариной лихорадкии тогавирус. Предпочтительно указанные специфические для клеток маркеры содержат, по меньшей мере, одноантитело. В одном из вариантов бифункциональный поперечносвязывающий агент связан с мембраной везикул в количестве, составляющем приблизительно от 5 до 10 по весу относительно всей мембраны. Предпочтительно фармацевтически активное вещество выбирают из группы, состоящей из декстрансульфата, димера рибонуклеазы, димера лизоцима, имидазолкарбоксамида, гидроксимочевины, адрибластина, эндоксана, фторурацила и колхицина. Изобретение позволяет получать виросомы вирусного гемагглютинина, которые содержат идеально подходящие для эндоцитоза липосомы и специфические клеточные маркеры, обладающие полной биологической активностью, предпочтительно гемагглютининовые вирусные гликопротеины или их производные, а также синтетические слитые пептиды, способные индуцировать быстрое слияние указанных виросом с определенным типом клеток сразу после завершения эндоцитоза. Другое преимущество изобретения состоит в использовании подходящих агентов, обеспечивающих перекрестную сшивку, которые адсорбируются на специфических липосомах, в смеси со специфическими антителами к рецепторам, для запуска механизма эндоцитоза в клетках данного типа антитела взаимодействуют со сшивающими агентами таким образом, что полностью сохраняют биологическую активность. Существенным признаком этих везикул является наличие на их поверхности указанных вирусных гликопротеинов или их производных, в полной мере сохраняющих активность, и биологически активных специфических антител, которые обладают способностью прикрепляться к нужным клеткам, подвергаются интернализации в процессе фагоцитоза или эндоцитоза и индуцируют слияние указанных везикул с внутренними цитоплазматическими мембранами и освобождение содержимого вирусом в цитоплазму данных клеток. Благодаря использованию активных слитых пептидов, согласно настоящему изобретению, освобождение лекарственных средств происходит сразу после фагоцитоза, что позволяет избежать нежелательного длительного пребывания их в эндоцитосомах, которое может приводить к неспецифической деградации фармацевтических продуктов, присутствующих в вирусных гемагглютининовых везикулах согласно настоящему изобретению. При рН 5 слитые пептиды вируса гриппа на поверхности везикул активируются посредством такого же механизма, как в случае живого вируса. Содержимое везикул освобождается в цитоплазму, как это имеет место в случае вируса гриппа от выделяемого нуклеопротеина. Термином липосома обозначаются двуслойные фосфолипиды среднего размера, которые получают в процессе контролируемого удаления детергентов. Первоначальный размер везикул, образующихся сразу после удаления детергента зависит от природы как детергента, так и фосфолипида, а в отдельных случаях - от способа и скорости удаления детергента. Термин слитый пептид относится к гликопротеиновым выростам на поверхности вируса, содержащим слитый пептид. В одном из вариантов, настоящее изобретение относится к полному тримеру гемагглютинина из выростов на поверхности вируса или к одному мономеру или к одному или обоим расщепленным субъединицам (гликопептидам НА 1 и НА 2), которые содержат функционально активный слитый пептид. В другом варианте изобретение относится к самому слитому пептиду, выделенному из природного материала или полученному синтетическим путем. Предпочтителен такой способ реализации изобретения, при котором эти полипептиды, содержащие слитый пептид, являются гемагглютининами вируса гриппа, особенно гемагглютинином подтипа -11. Понятие сшивающий агент применяется для обозначения органической гетерофункциональной молекулы,которая связывается с поверхностью везикул, полученных согласно настоящему изобретению, и присоединяет полипептиды. Предпочтительно, чтобы такая молекула представляла собой органическую бифункциональную молекулу, содержащую карбоксильную группу и тиоловую группу, в частности сульфосукцинимидил-(-) производное,например -4-(р-малеимидофенил)-бутират, -ацетат, -2-(-зиднитбнзмид)-этил-1,3-дитиопропионат,7-6-(4-зид-2-нитфнилмин)гкнт, -(4-азидофенилдитио)пропионат, -2(р-азидосалициламидо)этил 1,3-дитиопропионат,-2-(биотинамидо)-этил-1,3-дитиопропионат,-6-(биотинамидо)гексаноат,-3-(4 гидроксифенил)пропионат, -(4-йодоацетил)аминобензоат, -4-(-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, 2,2,5,5-тетраметилпирролин-1-оксил-НС 1. Термин специфичный для клетки белок или маркер используется для обозначения белка, способного присоединяться к сшивающему агенту на поверхности везикулы и связываться с клеточными рецепторами,что приводит к индукции механизма эндоцитоза. В предпочтительном способе реализации изобретения это понятие относится к специфичным для клеточных рецепторов антителам, особенно к моноклональным антителам. Нижеследующие примеры и чертежи иллюстрируют данное изобретение. Пример 1. Получение синтетических мембранных везикул фосфатидилхолина с полностью функционально активными слитыми пептидами в тримере гемагглютинина из вируса гриппа, содержащих в качестве антивирусного препарата декстран-сульфат. Фиг. 1 иллюстрирует принцип предлагаемой процедуры. Круги обозначают жидкий раствор или суспензию, квадраты - твердый осадок или преципитат. В общем виде процедура состоит в следующем. Слитой буферный раствор , содержащий 2700 мг твердого материала и суспензию гемагглютинина(НА), содержащую 46 мг НА и 31,1 мкмоля вирусного фосфолипида , перемешивают и центрифугируют (1). Образующийся осадок разводят в растворе , содержащем слитой буфери монододециловый эфир октаэтиленгликоля , служащего слабым детергентом. После повторного центрифугирования(2) получают надосадочную жидкость , содержащую , НА,и , и добавляют к ней противовирусный препарат декстран-сульфат . Конечный раствор обозначается символом . Растворфосфатидилхолинаупаривают под вакуумом во вращающейся колбе с округлым дном для получения тонкого слояна ее внутренней стенке. К этому слою добавляют раствори разводят его в растворе ,в который трижды последовательно помещают микроноситель в форме полистироловых бусин (РВМ) для удаления . В результате получают раствор , в котором с помощью ультразвуковой обработкиформируют везикулытребуемого размера. Конечную суспензиюразбавляют раствором,получая суспензию лекарственного средства . Слитой буферный растворсодержит 7,9 мг /мл, 4,4 мг/мл дигидрата тринатрий-цитрата, 2,1 мг/мл 2-морфолиноэтанового моногидрата сульфоновой кислотыи 1,2 мг/мл -гидроксиэтил-пиперазин-2-этансульфоновой кислоты в 2, доводя рН до 7,3 добавлением 1- . Вирус гриппа (штамм // 16/89 (32 выращивают в аллантоисе куриного яйца и дважды подвергают очистке ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, как описанои 1971 ( 44, 396-408). Суспензия очищенного вириона гриппасодержит 266 мкг вирусного гемагглютинина в 1 мл и в общей сложности 31,1 мкмоль фосфолипидов вируса гриппа, определение которых производят, как описано ниже. Вирусные фосфолипиды экстрагируют по методус соавторами (, ., , М. и ,(1957) . . . 226, 497-509). Для анализа фосфолипидов нижнюю органическую фазу упаривают, а остаток либо используют для определения фосфата (, . , и , . (1956) .. 28, 1756-1758), либо разводят в небольшом объеме смеси хлороформа и метанола для последующего анализа с помощью тонкослойной хроматографии на фосфолипиды. Используют пластинки из силикагеля, которые проявляют в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (251542, объемное соотношение). Индивидуальные фосфолипиды выявляют обработкой йодом и идентифицируют на основании значений ихв сопоставлении с контрольными образцами. Белок определяют с помощью модифицированной методики(, . (1977) . . 83,346-356). Растворв количестве 173 мл смешивают с равным объемом указанного объединенного буфера . Эту смесь, содержащую вирус гриппа, подвергают центрифугированию при 100000 в течение 10 минут до получения осадка. 15,3 мл раствора детергента, содержащего 54 мг/мл ( 100 мкмоль/мл) монододецилового эфира октаэтиленгликоляв указанном слитом буферном растворе добавляют к осадку, содержащему вирус гриппа, что дает 18 мкг 33,3 нмоляна 1 мкг гемагглютинина. Полное растворение осадка происходит к исходу 10 минут. Полученный раствор в течение часа подвергают ультрацентрифугированию при 100000 . 3000 мг сухого противовирусного препарата декстран-сульфата (, М. и , .,14, 39-50) добавляют к остающейся надосадочой жидкости , которая содержит растворенный тример гемагглютинина вируса гриппа, в комбинации с остатком заменяемой нейраминидазы и другими компонентами, получая таким образом раствор . В смеси хлороформа и метанола (21) разводят фосфатидилхолиндо конечной концентрации 10 мг/мл. 28 мл этого растворатщательно упаривают под вакуумом в роторном испарителе, формируя на внутренней поверхности круглодонной колбы тонкий слой фосфолипидов, содержащий их в количестве 280 мг. 8 3634 1 К фосфолипидному слою в круглодонной колбе добавляют раствор . После встряхивания колбы на протяжении, по меньшей мере, 15 минут и полного растворения фосфатидилхолина, переносят образующийся растворв стеклянный сосуд с 4,8 г микроносителя в форме полистироловых гранул (РВМ) размером 2650 меш (во влажном состоянии). Сосуд встряхивают таким образом, чтобы его содержимое перемещалось из одного конца в другой со скоростью два раза в секунду. Спустя час суспензию отсасывают через тонкую пипетку и переносят в другой сосуд, содержащий 2,4 г полистироловых гранул такого же размера, которые служат микроносителями. Колонку встряхивают на протяжении 30 минут. Процедуру повторяют дважды. По завершении ее образовавшийся растворснимают с гранул, помещают в водяную баню и подвергают ультразвуковой обработке с помощью аппарата при частоте 50 кГц 10 . Продолжительность каждой обработки 10 сек, ее повторяют дважды с интервалом 10 сек. В результате получают среднего размера везикулы диаметром приблизительно 50-100 нм. Конечный растворразбавляют физиологическим растворомв соотношении 1100. Пример 2. Препарат синтетических мембранных везикул, содержащий противовирусные антитела, адсорбированные на тримерах гемагглютинина вируса гриппа, и моноклональные антитела 4. Везикулы получают, как описано в примере 1, со следующими модификациями вместо 10 мг фосфатидилхолина используют только 9 мг в сочетании с 1 мг фосфатидилэтаноламина (кефалина) на 1 мл указанные соединения разводят в смеси хлороформа с метанолом в соотношении 21. После получения гемагглютининовых везикул, согласно процедуре, описанной в примере 1, к раствору добавляют 20 мг сульфосукцинимидил-4-(-малеимидо-фенил)-бутиратав 2 мл воды, который служит сшивающим агентом. Смесь выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре, слегка встряхивая ее, после чего подвергают ультрацентрифугированию при 100000 в течение 10 минут для осаждения везикул. К осадку добавляют 8 мл антилейцина 3 А ( и ). Ресуспендированный материал осторожно встряхивают в течение нескольких секунд каждые 5 минут на протяжении часа при комнатной температуре. На последней стадии полученный материал снова осаждают ультрацентрифугированием при 100000 в течение 10 мин (для удаления несвязанных антител). Осадок ресуспендируют в 1500 мл физиологического раствора . Пример 3. Повторяют процедуру, описанную в примере 2, со следующими модификациями. К раствору(см. пример 1) вместо декстран-сульфата добавляют по 1000 мг имидазол-карбоксамида и гидроксимочевины, которые по даннымиобладают фармацевтической активностью в отношении меланом ( , 2-е издание,, стр.93, 1979). После добавления сшивающего агента и продолжения процедуры в соответствии с описанием примера 2 к раствору везикулдобавляют 1 мг моноклональных антител (либо 24, как описано , а 1. (1985), . . . . . 82, стр. 1242 либо 0,5 мг 550,5 мг 72, как описано , а 1., (1989), стр. 786-787). В результате получают композицию следующего состава, содержащую 1000 доз для введения человеку 46 мг гемагглютинина 250 мг фосфатидилхолина 30 мг фосфатидилэтаноламина (кефалина) 20 мг сшивающего агента (сульфо-) 1 мг моноклональных антител 1000 мг имидазол-карбоксамида 1000 мг гидроксимочевины. Поскольку указанные средства до сих пор использовались примерно в пятикратных количествах, приведенные количества на самом деле обеспечивают получение лишь 200 доз. Пример 4. Повторяют процедуру, описанную в примере 2, со следующими модификациями. К раствору(см. пример 1) вместо декстран-сульфата добавляют по 1000 мг, по крайней мере, одного из нижеупомянутых соединений адрипластина, эндоксана, фторурацила (как описанои ,, -, 2-е издание, стр. 309, 1979) и колхицина . После добавления сшивающего агента и продолжения процедуры в соответствии с описанием примера 2 к раствору везикулдобавляют 1 мг моноклональных антител 1, как описано , , . . . 23, стр. 31, 1986). В результате получают композицию следующего состава, содержащую 1000 доз фармацевтического средства для лечения больных с карциномой грудной железы 46 мг гемагглютинина 250 мг фосфатидилхолина 30 мг фосфатидилэтаноламина 20 мг сшивающего агента (сульфо-) 1 мг моноклональных антител 9 3634 1 1000 мг адрипластина 1000 мг эндоксана 1000 мг фторурацила. Пример 5. Повторяют процедуры, описанные в примерах 1 и 2, со следующими модификациями. Вместо тримеров гемагглютинина вируса гриппа используют мономеры, содержащие слитый пептид. Мономер гемагглютина-2, содержащий слитый пептид, получают расщеплением - мостиков посредством химического восстановления 4-дитиотрентолом (, ), с последующим отделением от пептида гемагглютинина-1 с помощью гелевой хроматографии (50) при рН 6. Суспензия очищенного мономера гемагглютинина-2 содержит 180 мкг мономеров, в том числе слитый пептид. Пример 6. Повторяют процедуру, описанную в примере 2, со следующими модификациями. Вместо тримеров гемагглютинина вируса гриппа используют неочищенный слитый пептид. Слитый пептид вируса гриппа, используемый при синтезе мембранных везикул, получают методом химического синтеза. Для этой цели пригодна любая из приведенных на фиг. 2 аминокислотных последовательностей. Для обеспечения слияния концевой фрагмент соответствующей аминокислотной последовательности должен содержать, по крайней мере, один, предпочтительно три, цистеиновых остатка. Раствор с одним из таких синтетических слитых пептидов содержит его в концентрации 4 мкг/мл. Везикулы с одним из вышеуказанных слитых пептидов получают следующим образом. Раствор 9 мг фосфатидилхолина и 1 мг фосфатидилэтаноламина на 1 мл помещали в смесь хлороформа с метанолом в соотношении 21. 28 мл конечного раствора осторожно упаривали в вакуумном роторном испарителе, получая таким образом тонкий слой фосфолипидов на внутренних стенках круглодонной колбы. 3 г декстран-сульфата разводили в 15,3 мл раствора детергента, содержащего 100 мкмолей монододецилового эфира октаэтиленгликоля в 1 мл объединенного буферного раствора. Конечный раствор переносили на фосфолипидный слой на стенках круглодонной колбы, последнюю встряхивали на протяжении 15 минут и после полного растворения фосфолипидного слоя раствор переносили в стеклянный сосуд вместе с 4,8 г полистироловых гранул, служивших микроносителем, размером 25-50 меш (во влажном состоянии). После этого сосуд встряхивали таким образом, чтобы его содержимое перемещалось из одного конца в другой с частотой два раза в секунду. Спустя час суспензию отсасывали тонкой пипеткой и переносили в другой сосуд,содержавший 2,4 г полистироловых гранул вышеуказанного размера. Сосуд встряхивали в течение 30 минут. Процедуру повторяли дважды. По завершении ее образовавшийся раствор снимали с гранул, помещали в водяную баню и подвергали ультразвуковой обработке с помощью аппарата при частоте 50 кГц 10 , продолжительность каждой обработки составляла 10 сек., ее повторяли дважды с интервалом в 10 сек. В результате получали среднего размера везикулы диаметром приблизительно 50-100 нм. К полученной таким образом суспензии добавляли 2 мл воды, содержащей 20 мг сульфо- . Смесь выдерживали в течение одного часа при комнатной температуре, слегка встряхивая, после чего подвергали ее ультрацентрифугированию при 100000 в течение 15 минут для осаждения везикул. 2 мл раствора, содержащего синтетический слитый пептид добавляли к материалу полученного осадка. Ресуспендированный осадок осторожно встряхивали каждые 5 минут (по нескольку секунд) на протяжении часа при комнатной температуре. На последней стадии суспензию снова центрифугировали при 100000 в течение 10 мин для удаления несвязанного слитого пептида. Осадок ресуспендировали в 200 мл физиологического раствора . Пример 7. Повторяли процедуру, описанную в примере 6, со следующими модификациями. 2 мл раствора, содержащего 2 мкг синтетического слитого пептида, и 2 мл, содержащих 100 мкг антилейцина 3 А, добавляли к присутствовавшим в осадке везикулам. Ресуспендированный материал осторожно встряхивали в течение нескольких секунд каждые 5 минут на протяжении часа при комнатной температуре. Затем суспензию снова подвергали ультрацентрифугированию при 100000 в течение 10 минут для удаления несвязанных слитых и специфичных для клеток пептидов. Полученный осадок снова ресуспендировали в 200 мл физиологического раствора . Пример 8. В соответствии с процедурами, описанными в примерах 1-4, получали везикулы, содержавшие слитый пептид или гемагглютинин рабдовирусов, вирусов парагриппа или тогавирусов. а). Рабдовирус бешенства культивировали в человеческих диплоидных клетках. Полученный материал(надосадочную жидкость), содержавшую 107 вирусных частиц в 1 мл, подвергали очистке и концентрировали посредством ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Суспензия очищенного вируса бешенства содержала 210 мкг вирусного гемагглютинина в 1 мл. Ее дальнейшую обработку проводили, как описано в примере 1. б). Вирус парагриппа типакультивировали в аллантоисе куриного яйца и дважды подвергали очистке посредством ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, как описано в примере 1. Суспензия очищенного вириона парагриппа содержала 245 мкг гемагглютинина вируса парагриппа в 1 мл. Ее дальнейшую обработку проводили, как описано в примере 1. 3634 1 в). Тогавирус краснухи культивировали в человеческих диплоидных клетках и подвергали очистке, как описано в пункте (а). Суспензия очищенного вириона краснухи содержала 205 мкг гемагглютинина в 1 мл. Ее дальнейшую обработку производили, как описано в примере 1. Пример 9. Антивирусные средства получали, как описано в примере 1. Мышам линии на протяжении 14 дней вводили димер рибонуклеазы, чередуя его введение с введением на протяжении 10 дней только фосфатного буферного раствора (контроль). Вводили также декстран-сульфат или димер рибонуклеазы (полученные, как описано в примере 1 /90/00141) в трех разных дозах, декстран-сульфат в липосомах или димер рибонуклеазы в липосомах. Два последних препарата получали, как описано в примере 1 настоящего изобретения. Введение указанных препаратов производили одновременно с введением вируса гриппа 100 50 Н-1. Признаки вирусной инфекции (выделение вируса, определениепровирусных последовательностей) у мышей линии проводили спустя 3, 4 и 6 недель после ее начала. Результаты исследования показывают, что в зависимости от характера вводившихся препаратов частота выделения возбудителя у мышей различных групп составляла после введения фосфатного буферного раствора (контроль) 80 после введения димера рибонуклеазы в дозе 0,001 мг/кг 92 после введения димера рибонуклеазы в дозе 0,1 мг/кг 30 после введения димера рибонуклеазы в дозе 10,0 мг/кг 63 после введения декстран-сульфата в дозе 10 мг/кг 33 после введения декстран-сульфата в дозе 10 мг/кг в липосомах 14 после введения димера рибонуклеазы в липосомах 25 . Результаты исследования свидетельствуют о том, что инъекция каждые 12 часов димера рибонуклеазы в дозе 0,1 мг/кг веса тела, декстран-сульфата в дозе 10 мг/кг, липосом, содержащих димер рибонуклеазы, или липосом, содержащих декстран-сульфат, защищают мышей линии от инфекции вирусом гриппа. Защита была менее эффективной при использовании препарата димера рибонуклеазы в дозе 10 мг/кг, что может быть связано с подавлением иммунной реакции при высокой дозе димера. Его защитное действие в дозе 0,001 мг/кг отсутствовало. В то же время введение димера рибонуклеазы в составе липосом, согласно настоящему изобретению, повышало эффективность его защитного действия с 63 до 25 , несмотря на высокую дозу. Ожидается, что подбор оптимальных дозировок этого соединения позволит еще больше усилить фармакологическую активность липосомных препаратов. Этот вывод справедлив и для случая исключения из анализа мышей с неудовлетворительно функционирующими имплантатами человеческих ПЛв конце экспериментального периода, хотя из оценки уровня человеческих иммуноглобулинов и СПП-глобина следует, что введение липосом, содержащих димер рибонуклеазы или декстран-сульфат, снижает выживаемость человеческих клеток. Исключение из анализа мышей линии на основании результатов оценки функциональной активности человеческих клеток позволяет дифференцировать непосредственное противовирусное действие липосомных препаратов от их иммуномодуляторной активности. Пример 10. Везикулы, полученные, как описано в примере 1, сравнивали в тестеи(1990, 14, 39-50) с рекомбинированными везикулами вируса гриппа, полученными по методуи др. Оценивали характер их слияния с модельными мембранами. Фиг. 3 иллюстрирует кинетику ингибирования затухания флюоресценции вируса гриппа А, меченного 18, под воздействием липосом, содержащих -холестерин. Усиление флюоресценции выражали как степень подавления ее затухания в процентах, рассчитанную по методуи(см. выше). Начальную скорость слияния выражали через значения тангенсов кривых слияния в нулевой точке, соответствовавшей моменту инициирования этого процесса (пунктирная линия на фиг. 3). Кривая 2 характеризует активность слияния везикул, полученных по методикеи др. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.

МПК / Метки

МПК: A61K 9/127

Метки: фосфолипидные, везикулы, получения, способ, двухслойные

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/12-3634-dvuhslojjnye-fosfolipidnye-vezikuly-i-sposob-ih-polucheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Двухслойные фосфолипидные везикулы и способ их получения</a>

Похожие патенты